„Potencjalna rola kannabichromenu w modulowaniu kanałów TRP podczas zespołu ostrej niewydolności oddechowej”

 

        Zespół ostrej niewydolności oddechowej (ARDS) to zagrażający życiu zespół kliniczny, którego potencjał stania się jednym z najpoważniejszych wyzwań systemu opieki zdrowotnej udowodniła pandemia COVID-19. Biorąc pod uwagę brak leczenia ukierunkowanego na ARDS, absolutnie konieczne jest posiadanie skutecznej metody terapeutycznej w celu zmniejszenia liczby hospitalizacji i śmiertelności, a także poprawy jakości życia i wyników leczenia pacjentów z ARDS. Zespół ostrej niewydolności oddechowej jest ogólnoustrojową chorobą zapalną rozpoczynającą się od układu płucnego i obejmującą wszystkie inne narządy w dwukierunkowy sposób chorobowy. Coraz więcej dowodów, w tym nasze odkrycia, potwierdza pogląd, że kannabinoidy mogą być regulacyjną metodą terapeutyczną w leczeniu chorób zapalnych. Dlatego sensowne staje się przetestowanie ich możliwości jako terapii alternatywnych w leczeniu ARDS. W tym badaniu zbadaliśmy potencjalne działanie ochronne kannabichromenu (CBC) w eksperymentalnym modelu ARDS.

        Po raz pierwszy zastosowaliśmy wziewną terapię CBC jako potencjalny cel terapeutyczny w mysim modelu objawów podobnych do ARDS. ARDS został wywołany przez donosowe podanie Poly(I:C), syntetycznego niedopasowanego dwuniciowego RNA, myszom C57BL/6 (6-10 samców myszy na grupę, w tym leczenie pozorowane, placebo i CBC), w trzech jednorazowych dawkach dobowych, a następnie dawka dobowa wziewnego CBC lub placebo przez okres 8 dni, począwszy od pierwszej dawki 2 godziny po drugim leczeniu Poly(I:C). Do oceny wyników zastosowaliśmy metody histologiczne, immunohistochemiczne i cytometrii przepływowej. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu post hoc Newmana-Keulsa w celu określenia różnic między średnimi wszystkich grup eksperymentalnych i ustalenia istotności (p < 0,05) między wszystkimi grupami.

        Nasze dane wykazały, że CBC jest w stanie odwrócić hipoksję (zwiększając wysycenie krwi O2 o 8%), złagodzić objawy ARDS (redukując o 50% prozapalne cytokiny w płucach i krwi) oraz chronić tkanki płuc przed dalszą destrukcją. Dalsza analiza wykazała, że CBC może wywierać działanie ochronne poprzez kanały kationowe przejściowego potencjału receptora (TRP), TRPA1 i TRPV1, zwiększając ich ekspresję 5-krotnie w tkankach płuc w porównaniu do myszy pozorowanych i nieleczonych, przywracając homeostazę i równowagę immunologiczną.

        Nasze odkrycia sugerują, że wziewne CBC może być skutecznym alternatywnym celem terapeutycznym w leczeniu ARDS. Ponadto zwiększona ekspresja kanałów kationowych TRP po leczeniu CBC sugeruje nową rolę TRP (TRPA1 i TRPV2) jako potencjalnego mechanizmu interpretacji korzystnych efektów CBC, a także innych kannabinoidów w leczeniu ARDS oraz innych chorób zapalnych. Co ważne, dostarczanie CBC za pomocą inhalatora jest modelem translacyjnym wspierającym wykonalność próby na ludziach, upoważniającym do dalszych badań.

Wprowadzenie

       Zespół ostrej niewydolności oddechowej (ARDS) jest poważnym powikłaniem sepsy, zapoczątkowanym przez burzę cytokinową z powodu braku równowagi odporności gospodarza z przesadnymi reakcjami zapalnymi. Pomimo kontrowersji w definicji ARDS, istnieje zgoda co do kluczowej roli rozregulowania odpowiedzi immunologicznej w patofizjologii zespołu ostrej niewydolności oddechowej. Jako ogólnoustrojowa choroba zapalna, ARDS jest inicjowany przez aktywację makrofagów pęcherzykowych, rekrutację neutrofili i krążenie makrofagów w obciążonych tkankach płuc. W konsekwencji takich aktywacji komórkowych, ARDS postępuje z podwyższonym poziomem cytokin prozapalnych, takich jak IL-6, IL-17 i IFNγ, uszkadzając tkanki płuc i wywołując akumulację makrocząsteczek objawiającą się obrzękiem i hipoksemią. W przeciwieństwie do wszystkich postępów w zrozumieniu mechanizmów i patofizjologii ARDS, nie zidentyfikowano jeszcze żadnej farmakologicznej modalności leczenia zespołu ostrej niewydolności oddechowej. Jak dowodzi pandemia COVID-19, terapie wspomagające wraz z terapiami skojarzonymi, takimi jak kortykosteroid i inhibitor IL-6, wykazały korzystne efekty w leczeniu ARDS. Dlatego nadal istnieje potrzeba opracowania alternatywnych nowych celów terapeutycznych w zapobieganiu i leczeniu zespołu ostrej niewydolności oddechowej.

      Kannabinoidy są naturalnie występującymi związkami w roślinach konopi. Liczne badania sugerują korzystne działanie kannabinoidów w warunkach klinicznych. Spośród ponad 100 znanych kannabinoidów cztery, w tym Δ9-THC, CBD, CBN i CBC, przyciągnęły największą uwagę ze względu na dowody potwierdzające ich potencjał jako celów terapeutycznych. Pomimo różnic strukturalnych, zarówno CBD, jak i CBC są związkami niepsychoaktywnymi o potencjalnym działaniu immunomodulującym i kilku innych korzyściach zdrowotnych. Niedawno w serii badań przedklinicznych wykazaliśmy po raz pierwszy, że CBD może złagodzić objawy ARDS. Co ważne, w przeciwieństwie do THC i CBD, CBC nie jest traktowane jako związek zaklasyfikowany przez amerykańską Agencję ds. Przeciwdziałania Narkomanii (DEA), co może ułatwić stosowanie i ocenę CBC w warunkach klinicznych. Ponadto, kilka doniesień sugeruje, że CBC może działać poprzez TRPA1, jak również TRPV1 z mniejszym powinowactwem. Oba TRP są zaangażowane w ogromną różnorodność życiowych procesów komórkowych, wpływając na dynamikę interakcji fizjologicznych i immunologicznych w organizmie wielokomórkowym. Wiązanie CBC do TRP prawdopodobnie wpłynęłoby na homeostazę tkanek i równowagę immunologiczną, modulując reakcje zapalne, a także wychwyt komórkowy endokannabinoidów. Doniesiono również, że CBC jest agonistą receptora CB2, którego aktywacja może dalej modulować odpowiedzi zapalne.

W tym badaniu zbadaliśmy potencjalne ochronne działanie CBC, możliwe mechanizmy działania i czy CBC może poprawić objawy w eksperymentalnym modelu ARDS.

Materiały i metody

Zwierzęta

W badaniach wykorzystano samce myszy C57BL/6 w wieku 10-12 tygodni, które otrzymano z Jackson Laboratory USA i trzymano w laboratoriach dla zwierząt laboratoryjnych Uniwersytetu Augusta ze swobodnym dostępem do pożywienia i wody. Badania te były zgodne z wytycznymi Institutional Animal Care and Use Committee.

Projekt eksperymentalny

ARDS wywołano jak opisano wcześniej. W skrócie, myszy podzielono na trzy grupy: pozorowaną, kontrolną i leczoną (n = 6-10) w sposób otwarty, aby zbadać skuteczność leczenia. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono zgodnie z zasadami i regulacjami Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Augusta (IACUC). Wszystkie myszy znieczulono izofluranem. Grupa pozorowana otrzymała sól fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS), podczas gdy grupom kontrolnym i leczonym podano donosowo (IN) Poly(I:C) (100 mg w 50 ml sterylnego PBS) trzy dawki raz dziennie. CBC był dostarczony przez BayMedica USA i podawany przez inhalator (5 mg/kg), pierwsza dawka 2 godziny po drugim leczeniu Poly(I:C), i co drugi dzień, łącznie trzy dawki w grupie leczonej. Dawkę i drogę podawania leku ustalono na podstawie wcześniejszych niezależnych oraz własnych badań. Dostarczanie wziewne zapewnia korzyści, w tym miejscowe dostarczanie leku z oczekiwanymi minimalnymi skutkami ubocznymi, szybkim początkiem i wysoką skutecznością działania w miejscu docelowym oraz symulacją wspólnej drogi podania obserwowanej w scenariuszach klinicznych. Grupy pozorowane i grupy kontrolne otrzymywały placebo wyłącznie przez inhalator z nośnikiem. Wszystkie myszy uśmiercono w 8 dni po pierwszym zastosowaniu Poly(I:C). Pobrano krew i tkanki płucne, które poddano dalszej analizie. Wysycenie krwi tlenem mierzono za pomocą przenośnego pulsoksymetru przez tętnice szyjne, przed i po jakimkolwiek leczeniu.

Histologia i immunohistochemia

Wiele zatopionych w śródkoronowej parafinie skrawków tkanek płuc o grubości 5 μm wycięto i wybarwiono hematoksyliną i eozyną lub trichromem. […] skrawki parafinowe tkanek płuc odparafinowano w ksylenie i ponownie uwodniono przepuszczając szkiełka przez roztwory alkoholi. Endogenną peroksydazę zgaszono 3% H2O2 w PBS. Skrawki następnie przemyto wodą destylowaną i ogrzewano w 95 °C w buforze do odzyskiwania antygenu. Barwienie niespecyficzne zablokowano 5% normalną surowicą kozią w PBS przez 1 godzinę. Endogenną biotynę hamowano zestawem blokującym awidyna/biotyna. Skrawki następnie inkubowano z anty-mysim TRPA1 i TRPV1. Preparaty wybarwiono kontrastowo hematoksyliną, osadzono w Faramount i zobrazowano pod mikroskopem w jasnym polu. Ekspresję TRPA1 i TRPV1 określono ilościowo za pomocą pomiaru liczby cząstek i intensywności koloru w oprogramowaniu ImageJ w wersji 1.53.

Analizy cytometrii przepływowej

Do analitycznej cytometrii przepływowej przygotowano zawiesinę pojedynczych komórek z tkanek płuc i krwi: próbki tkanek przesiano przez filtr do komórek 100 μM, a następnie odwirowano (252 μg, 10 μM) w celu przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek. Następnie komórki utrwalano, permeabilizowano i barwiono wewnątrzkomórkowo pod kątem cytokin, w tym IL-6, IL-17 i interferonu gamma (IFNγ) (cytokiny prozapalne). Wszystkie próbki przepuszczono przez cytometr przepływowy 4-Laser LSR II. Komórki bramkowano w oparciu o właściwości rozpraszania przedniego i bocznego oraz kombinacje markerów, aby wybrać interesujące komórki. Wszystkie uzyskane dane z cytometrii przepływowej zostały przeanalizowane przy użyciu FlowJo V10. Do oceny wyników wykorzystano również wykresy i statystyki podsumowujące.

Statystyka

W celu określenia różnic statystycznych między średnimi wszystkich grup eksperymentalnych, dane przeanalizowano za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu post hoc Newmana-Keulsa dla porównań wielokrotnych i ustalenia istotności (p < 0,05) między wszystkimi grupami .

Wyniki

Wziewna morfologia krwi odwróciła hipoksję, zwiększając saturację krwi dodatnio do poziomu normalnego o 8% z 90% do 98% (+/− 0,5%). Badanie histologiczne tkanek płucnych, barwienie hematoksyliną i eozyną oraz barwienie trichromem Massona wykazało, że leczenie CBC zmniejszyło zniszczenie płuc podobne do ARDS, poprawiło uszkodzenia strukturalne płuc. Dalsze badania histologiczne, immunohistochemia wykazały, że leczenie CBC zwiększyło poziom ekspresji kanałów potencjału receptora przejściowego (TRP) ankyrin typu 1 (TRPA1) i waniloidowego typu 1 (TRPV1), co sugeruje aktywną interakcję między CBC i TRP. Analiza cytometrii przepływowej krwi i płuc wykazała, że leczenie CBC ograniczyło poziomy ekspresji cytokin prozapalnych, w tym IL-6, IL-17 i IFNγ w obu tkankach w porównaniu z nieleczonymi odpowiednikami (p < 0,01). Histogramy pokazują ilościowy poziom ekspresji IL-6, IL-17 i IFNγ w obu tkankach traktowanych CBC w porównaniu z grupą kontrolną pozorowaną (nietraktowaną CBC).

Dyskusja

Nasze odkrycia wykazały po raz pierwszy, że wziewny CBC chronił strukturę płuc, zawierał nadmierną produkcję cytokin i ograniczał reakcje zapalne zarówno w tkankach płuc, jak i krwi w eksperymentalnym modelu ARDS. Wyniki te były zgodne z wynikami innych niezależnych badań wykazujących działanie przeciwzapalne CBC w obrzęku łap wywołanym przez Lipopolisacharydy. Ponadto CBC jest niepsychoaktywnym kannabinoidem, który nie jest sklasyfikowany jako zarejestrowany związek przez DEA. Może to ułatwić zastosowanie i ocenę CBC w warunkach klinicznych. Co ważniejsze, użycie inhalatorów po raz pierwszy w warunkach terapeutycznych zapewniłoby skuteczny i bezpieczniejszy sposób dostarczania CBC do małych dróg oddechowych, obniżając wymagane dawki i redukując wszelkie potencjalne ogólnoustrojowe objawy niepożądane w bardziej opłacalny sposób. Ponadto dostarczanie CBC przez inhalator zwiększa wartości translacyjne tego badania i potencjał badań w warunkach klinicznych z implikacjami dla leczenia powikłań oddechowych, takich jak rozwój ARDS w ciężkich przypadkach COVID-19 i kilku chorobach układu oddechowego. Warto zauważyć, że w naszych badaniach używaliśmy wyłącznie samców, aby zapobiec dodatkowym czynnikom zakłócającym wynikającym z różnic płci (np. różne etapy cyklu rujowego, efekty hormonalne), skupiając się na potwierdzeniu koncepcji działania samego CBC w ARDS. Jednak coraz więcej dowodów sugeruje kluczową rolę dymorfizmu płci w występowaniu i wynikach ARDS, co uzasadnia dalsze badania na poziomie przedklinicznym, a także potencjalne badania kliniczne na ludziach w przyszłości.

Co więcej, nasze dane wykazały, że CBC może zwiększać poziom ekspresji TRPA1 i TRPV1 […] Nadrodzina kanałów TRP odgrywa istotną rolę w wielu procesach fizjologicznych immunologicznych, takich jak polaryzacja komórkowa, wytwarzanie cytokin, fagocytoza i cytotoksyczność. Dlatego bardzo prawdopodobne jest postawienie hipotezy, że wiązanie CBC z TRP może zmniejszać reakcje zapalne, zmieniając tak zwaną „burzę cytokinową” w „bryzę cytokinową”, przywracając homeostazę i zapobiegając dodatkowym uszkodzeniom strukturalnym ważnych narządów. […] zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, jest to pierwsze sprawozdanie, które pokazuje korzystne efekty wzajemnego oddziaływania między CBC i TRP w ARDS. Ponadto, ponieważ kilka badań wykazało, że CBC może wiązać się i aktywować receptor CB2 układu endokannabinoidowego, sugeruje to potencjalną synergię między TRP a aktywacją CB2 jako potencjalny mechanizm przyczyniający się do korzystnych efektów CBC w ARDS. W rzeczywistości takie potencjalne zaangażowanie układu endokannabinoidowego przez CBC może ustanowić synergistyczny związek między egzogennymi fitokannabinoidami (CBC) a endogennymi endokannabinoidami (np. anandamidem i 2-AG). Taka dwukierunkowa dynamika miałaby potencjał jako modalność terapeutyczna w leczeniu ARDS, jak również szerokiej gamy chorób zapalnych, chorób neurodegeneracyjnych, kontroli bólu, raka, przewlekłych ran i zaburzeń snu.

Wniosek

Te odkrycia nadają CBC nową rolę terapeutyczną w leczeniu ARDS, a także szerokiej gamy chorób układu oddechowego, w tym potencjalnie COVID-19 i innych stanów zapalnych. Zastosowanie CBC wziewnie i bezpośrednie dostarczanie CBC do płuc zapewnia szybszy początek działania, umożliwia stosowanie mniejszych dawek i ma lepszy stosunek skuteczności do bezpieczeństwa w porównaniu z terapią systemową. Ponadto, ponieważ TRP stają się nowymi celami terapeutycznymi poprzez ich potencjalną rolę w interakcjach komórkowych i homeostazie tkanek, możliwe jest zatem przewidzenie bardziej znaczących ról CBC w homeostazie tkanek, modulacji odpowiedzi zapalnych, oraz koordynowanie zestawu interakcji komórkowych jako celu immunoterapeutycznego, co gwarantuje dalsze badania.

 

 

Źródło:

Hesam Khodadadi, Évila Lopes Salles, Eunice Shin, Abbas Jarrahi, Vincenzo Costigliola, Pritesh Kumar, Jack C. Yu, John C. Morgan, David C. Hess, Kumar Vaibhav, Krishnan M. Dhandapani & Babak Baban „A potential role for cannabichromene in modulating TRP channels during acute respiratory distress syndrome” [w:] jcannabisresearch.biomedcentral.com